ЕЛЕКТРОФОРЕЗ. ВИЗНАЧЕННЯ ЕЛЕКТРИЧНОГО ЗАРЯДУ АМІНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ НА ПАПЕРІ

Суть методу полягає в тому, що якщо частка з зарядом q знаходиться в непроводящей середовищі в електричному полі Е, вона буде рухатися з постійною швидкістю v, яка визначається співвідношенням між електричною силою Eq і силою опору в'язкої середовища Jv, де / - коефіцієнт тертя. Звідси

Рухливість і визначається як швидкість на одиницю напруженості електричного поля, або

Рухливість залежить від коефіцієнта тертя f який є функцією деяких фізичних параметрів молекул. Тому значення і дає інформацію про величину і форму молекули. Однак дані електрофорезу не можуть бути детальною інформацією про макромолекулярной структурі досліджуваних частинок, так як на рух частинок під дією електричного поля великий вплив робить середовище, в якій здійснюється рух.

Існують наступні основні типи електрофорезу: з рухомою границею, зональний і безперервний.

Електрофорез з рухомою границею - порівняно рідко використовується метод, є аналітичним і придатним в основному для аналізу білків.

Зональний електрофорез використовують в якості аналітичної і препаративної методики. Аналітична методика полягає у визначенні складу або ступеня чистоти зразка (суміш амінокислот, білків або інших несучих заряд частинок). Препаративна полягає в поділі різних амінокислот.

Безперервний електрофорез - препаративна методика, яка використовується для поділу не тільки амінокислот, але і інших біогенних молекул (білків, ДНК, РНК та інших амфолітов).

Електрофорез на папері відноситься до зональному електрофорез, так як досліджуваний зразок наноситься у вигляді невеликої зони. Даний метод є найбільш простим методом поділу амінокислот і полягає в тому, що дуже невелика кількість розчину (крапля), що містить суміш амінокислот, наносять на центральну частину смужки фільтрувального паперу, заздалегідь просоченої буфером з певним pH, і прикладають до кінців смужки напруга, що створює електричне поле. Амінокислоти в залежності від знака заряду під дією напруги переміщаються по смужці в ту або іншу сторону. При цьому швидкість руху амінокислоти буде залежати від величини її сумарного заряду. Через певний час напруга знімають, смужку висушують і для прояву розташування амінокислот сприскують «проявником», наприклад нингидрином (2,2-дігідроксі- 1,3-індандіону), який взаємодіє з амінокислотами при слабкому нагріванні з утворенням забарвлених сполук (бузкове і синє забарвлення ) (хімічну реакцію див. нижче в розділі «Характерні хімічні реакції амінокислот», рис. 3.5). Схема електрофорезу на папері приведена на рис. 3.2. Смужка фільтрувального паперу з розділеними амінокислотами називається електрофореграмме.

Схема електрофорезу на папері

Мал. 3.2. Схема електрофорезу на папері

Якщо потрібно кількісне визначення, речовина з досліджуваного зразка можна елюіровать (вимивати) і визначати спектрофотометрически.

Багато біомолекули адсорбуються на папері (ацетат целюлози), що перешкоджає руху і тим самим отримання чітких результатів аналізу. Явище адсорбції на папері характерно для великих молекул, таких як білки, тому для електрофорезу макромолекул застосовують інші носії, наприклад мембрани з ацетату целюлози або гелі з крохмалю, агарози і т. П.

 
Переглянути оригінал
< Попер   ЗМІСТ   ОРИГІНАЛ   Наст >