МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ ТА АНАЛІЗУ БІЛКІВ

Вивчення хімічної структури білків починається з їх гідролізу. Виділені з органів і тканин білки гідролізуються в

  • 6 .. .12N H 2 S0 4 або НС1 протягом 6 ... 20 год при 100 ... ПО ° С. У цих умовах білки розпадаються з утворенням амінокислот. Однак при кислотному гідролізі руйнуються триптофан, частково серин і треонін. Для запобігання цих амінокислот від руйнування вдаються до гідролізу білків в 2N лугу при
  • 100 ... 110 ° С. У свою чергу, лужний гідроліз руйнує і ряд інших амінокислот (аргінін, цистин, серин і треонін), а також призводить до рацемизации (втрати оптичної активності) амінокислот.

Більш надійний метод, запозичений у живої природи, - гідроліз за допомогою протеолітичних ферментів. В організмі розщеплення білка каталізується ферментами - протеазами. Ферментативні методи гідролізу особливо цінні завдяки властивою їм у багатьох випадках специфічності. Наприклад, фермент трипсин розщеплює тільки ті пептидні зв'язку, у яких карбонильная група належить одній з основних амінокислот (лізину, аргініну) (табл. 3.4).

Таблиця 3.4

Відомості про властивості найбільш важливих протеолітичних ферментів

протеаза

Місце синтезу

оптимум pH

Специфічність (яких атакували зв'язку)

пепсин

шлунок

1,5 ... 2,5

... R-Phe ... R-Туг ... Leu - Gin ... Leu - Val

трипсин

підшлункова

заліза

7,5 ... 8,5

... Arg - R ... Lys-R

хімотрипсин

підшлункова

заліза

7,5 ... 8,5

... Tyr-R ... Phe-R

Комбінуючи методи кислотного, лужного і ферментативного гідролізу, за допомогою різних методів аналізу амінокислот можна встановити амінокислотну послідовність білка.

Амінокислотну послідовність білка прийнято позначати ланцюгом з трибуквених або однобуквених символів відповідних амінокислот. Першим природним полипептидом, чия амінокислотна послідовність була встановлена, став інсулін:

Наявність іонізованих груп в бокових ланцюгах поліпептиду обумовлює Електролітну природу білків. Частка іонізованих кінцевих груп поліпептидного ланцюга надзвичайно мала. Ступінь іонізації бічних груп залежить від pH середовища. Значення pH, при якому білкова молекула має однакове число позитивних і негативних іонізованих груп, носить назву ізоелектричної точки білка (ВЕТ). У ВЕТ розчинність білка мінімальна; білок залишається нерухомим в електричному полі постійного струму. Кожен індивідуальний білок характеризується своїм значенням ВЕТ.

При додаванні водневих іонів знижується pH середовища, і білок внаслідок придушення дисоціації карбоксильних груп знаходиться в формі катіона. При додаванні лугу підвищується pH, заряд білкової молекули змінюється на негативний і молекула білка стає аніоном. Таким чином, білки відносяться до поліамфоліта.

Титрування. Метод титрування, описаний в гл. 2 як спосіб визначення р До а слабких кислот, підстав і амінокислот, використовується також як метод ідентифікації і визначення ізо- електричних точок білків.

Графічна залежність величини pH середовища від кількості доданих кислоти або лугу (іонів Н + або ОН - ) називається кривою титрування білка. Для кожного білка крива титрування індивідуальна і залежить від набору і кількості в складі білка амінокислотних радикалів і значень їх р До а . Буферна ємність білків залежить від кількості наявних однаково іонізуючих функціональних груп амінокислотних радикалів. На базі кривих титрування розроблені амінокислотні аналізатори pH, за допомогою яких проводиться аналіз біологічних рідин на вміст різних амінокислот.

Для того щоб провести аналіз біологічної рідини на вміст різних амінокислот, необхідно знати значення їх рК а .

 
Переглянути оригінал
< Попер   ЗМІСТ   ОРИГІНАЛ   Наст >