ГЕЛЬ-ПРОНИКАЮЧА ХРОМАТОГРАФІЯ (ГЕЛЬ-ФІЛЬТРАЦІЯ).

Гель-проникаюча хроматографія (її іноді називають молекулярно-ситової хроматографією) є методом розподільної хроматографії, так як заснована на поділі молекул за рахунок різниці їх розмірів. Цей метод дозволяє розділити білки як за формою, так і за величиною. Поділ проводять на хроматографічних колонках (рис. 3.6), заповнених сферичними гранулами набряклого гелю полімеру (розміри гранул гелю можуть

Схема гель-фільтрації

Мал. 3.6. Схема гель-фільтрації:

а - на колонку, заповнену декстринового гранулами, наноситься суміш великих і маленьких білків; б - у міру проходження вниз по колонці молекули малого білка проникають в гранули і затримуються; в -молекули більшого білка першими виходять з колонки змінюватися від 10 до 500 мкм). Гранули гелю мають внутрішні канали (пори), що характеризуються певним середнім розміром, від якого залежить їх проникність. Суміш білків при пропущенні її через колонку в залежності від розмірів окремих білкових молекул просторово розділяється. Великі білкові молекули, які не здатні проникати в гранули гелю, переміщаються по колонці з високою швидкістю. Середні і дрібні білкові молекули утримуються в порах гелю в залежності від розміру. У верхній частині колонки утримуються найдрібніші молекули через їх високу здатність проникати всередину частинок гелю. При Елюювання буферним розчином першими виходять найбільші молекули білків. Елюат збирають окремими фракціями. Чим вище обсяг елюата, витраченого на вихід з колонки певної фракції білка, тим нижче молекулярна маса білка в даній фракції.

Аффинная хроматографія. Даний метод є високоспецифічний і ефективним для виділення білків. Багато традиційні методи виділення і очищення, що використовуються в органічній хімії, такі як сублімація та екстрагування різними розчинниками, не придатні для більшості білків через те, що їх молекули легко руйнуються. Тому для виділення і очищення білків розроблені спеціальні методи, якими вдається виділити який-небудь один з білків, присутніх в суміші, що містить кілька тисяч інших біомолекул, в концентрації КГ 5 ... КГ 6 М. Один з таких методів, метод афінної хроматографії ( рис. 3.7), зіграв вирішальну роль при виділенні і очищенні рецепторних білків, ряду ферментів і імуноглобулінів. В основі методу лежить добре відомий факт, що білки, виконуючи властиві їм біологічні функції, зворотно зв'язуються з іншими специфічними видами молекул, званих лігандами. В результаті утворюються міцні Нековалентні білково лігандні комплекси.

Принципова схема виділення білків методом афінної хроматографії

Мал. 3.7. Принципова схема виділення білків методом афінної хроматографії

За цим методом ліганд, специфічно зв'язується з білком, який необхідно виділити, ковалентно приєднується до нерозчинним полімерним гранулам діаметром 10 ... 50 мкм. Для виділення цього білка з клітинного екстракту останній вносять в колонку, заповнену полімерними гранулами з приєднаним до них лигандом, після чого колонку кілька разів промивають буферним розчином. При цьому на колонці утримуються лише ті білки, які мають високу спорідненість до закріпленого на полімері ліганду; інші ж просто вимиваються буфером. Оскільки спорідненість і специфічність білка до ліганду дуже високі, часто в один прийом можна виділити і очистити надзвичайно малі кількості білка з клітинного екстракту, що містить сотні інших білків.

 
Переглянути оригінал
< Попер   ЗМІСТ   ОРИГІНАЛ   Наст >