ЗАЛЕЖНІСТЬ ШВИДКОСТІ ФЕРМЕНТАТИВНОЇ РЕАКЦІЇ ВІД КОНЦЕНТРАЦІЇ СУБСТРАТА, СЕРЕДОВИЩА І ТЕМПЕРАТУРИ. РІВНЯННЯ МІХАЕЛІСА-МЕНТІВ ТА ЙОГО ПАРАМЕТРИ

Загальні принципи кінетики хімічних реакцій можна застосувати й до ферментативним реакцій. На підставі великого числа експериментальних досліджень було встановлено, що залежність швидкості ферментативного процесу від концентрації субстрату в загальному вигляді можна представити кривої, зображеної на рис. 5.5.

Загальний вид залежності стаціонарної швидкості протікання ферментативної реакції (v  ) від концентрації субстрату ([S]) при постійній концентрації ферменту

Мал. 5.5. Загальний вид залежності стаціонарної швидкості протікання ферментативної реакції (v CT ) від концентрації субстрату ([S]) при постійній концентрації ферменту:

а - реакція першого порядку (при [S] < Км швидкість реакції пропорційна концентрації субстрату); б - реакція змішаного порядку; в - реакція нульового порядку, коли v ct ~ v max і швидкість реакції не залежить від концентрації субстрату

При низькій концентрації субстрату залежність стаціонарної швидкості реакції від концентрації субстрату (див. Рис. 5.5, ділянка а) близька до лінійної і підпорядковується кінетиці реакцій першого порядку, т. Е. Швидкість реакції S - * Р прямо пропорційна концентрації субстрату S і в будь-який момент часу t визначається наступним кінетичним рівнянням: де [S] - молярна концентрація субстрату S; - d [S] / d / - швидкість убутку субстрату; до константа швидкості реакції, яка в даному випадку має розмірність, обернену одиниці часу. При високій концентрації субстрату (ділянка в) швидкість реакції максимальна, постійна і не залежить від концентрації субстрату [S]. У цих умовах реакція підпорядковується кінетиці реакцій нульового порядку v = до " і цілком визначається концентрацією ферменту.

В даному випадку проявляється важлива особливість ферментативних реакцій - явище насичення ферменту субстратом. На ділянці б швидкість реакції пропорційна добутку концентрацій двох реагуючих речовин (субстрату і ферменту), т. Е. Реакція протікає за законами реакції другого порядку. З наведеної на рис. 5.5 залежно видно, що зміна концентрації субстрату в області низьких значень істотно впливає на швидкість процесу, а при високих концентраціях субстрату цей вплив дуже мало або практично відсутній. При низьких концентраціях субстрату швидкість реакції контролюється двома факторами: власне швидкістю катализируемой ферментом реакції і частотою зіткнення ферменту з субстратом. У міру збільшення концентрації субстрату частота зіткнень перестає бути фактором, що визначає швидкість реакції.

Рівняння кінетики послідовних реакцій (5.5), (5.8), (5.9) справедливі і для кінетики ферментативних реакцій, ретельне вивчення яких показало, що загальний вигляд кінетичних кривих витрачання субстрату S має 5-подібний вид, типовий для реакцій послідовного перетворення (рис. 5.6 ).

Загальний вигляд кінетичної кривої витрачання субстрату S

Мал. 5.6. Загальний вигляд кінетичної кривої витрачання субстрату S:

I - початкова ділянка (період індукції), який триває менше часток секунди і займає незначну частину загального часу протікання реакції. Тут швидкість змінюється від нульової до v CT ; II - стаціонарний ділянку. На цій ділянці швидкість залишається приблизно постійною протягом декількох хвилин; III - основна ділянка, на який припадає велика частина часу протікання реакції; тут швидкість монотонно падає

Такий вигляд кривої витрачання субстрату за моделлю, запропонованою Міхаелісом і Ментен, пояснюється утворенням проміжного комплексу в ферментативном процесі: під час ферментативної реакції субстрат S утворює з молекулою ферменту Е з'єднання - фермент-субстратної комплекс ES, розпадається за двома напрямками. При розпаді по першому шляху знову утворюється вихідна молекула субстрату S і ферменту Е. При розпаді іншим шляхом утворюється молекула продукту Р і регенерується молекула ферменту. Таким чином, механізм ферментативного процесу (ферментативного каталізу) описується як послідовна реакція фермент + субстрат фермент-субстратної комплекс - "продукт + фермент, в якій фермент Е зв'язується з субстратом S в оборотної реакції (константи швидкостей до, до 2 ) з утворенням фермент субстратного комплексу ES. Останній розпадається в реакції з константою швидкості Аз на фермент Е і продукт Р:

Експериментальні докази розглянутого механізму дії ферментів вперше отримали Л. Міхаеліс та М. Ментен (1913), що прийняли, що проміжний фермент-субстратної комплекс ES оборотно утворюється відповідно до закону дії мас:

Вони вважали, що швидкість розпаду ES з утворенням продукту Р мала в порівнянні зі швидкістю встановлення рівноваги, що визначається до і до 2 . На підставі даних припущень було виведено рівняння, назване на честь авторів рівнянням Міхаеліса-Ментен, що виражає кількісне співвідношення між концентрацією субстрату і стаціонарної швидкістю ферментативної реакції:

де v max - максимальна швидкість реакції при великих концентраціях субстрату (див. рис. 5.6), а К м - константа Міхаеліса, що представляє собою константу дисоціації фермент-субстратного комплексу на фермент і вихідний субстрат. . В

моделі передбачається, що продукт не може назад перетворюватися в субстрат (що справедливо для ранніх стадій реакції, коли концентрація продукту низька). Оскільки на початковій стадії реакції концентрація Р мала, то і ймовірність зворотної реакції продукту з ферментом нескінченно мала, і тоді до } визначає швидкість всього процесу. У цьому випадку швидкість ферментативної реакції v CT визначається як ,

що і підтверджує наявність прямолінійного початкової ділянки на рис. 5.6.

Надалі ця модель була розвинена з урахуванням того, що концентрація фермент-субстратного комплексу ES може зменшуватися з помітною швидкістю.

У рівнянні Міхаеліса-Ментен (5.12) величини v max , К м постійні для даного ферменту, хоча можуть змінюватися незалежно один від одного при різних умовах.

Якщо [S] « До м , то

і реакція підпорядковується рівнянню першого порядку.

При [S] » До м

Це означає, що реакція не залежить від концентрації субстрату і протікає по рівнянню нульового порядку.

При К м = [S], г ст = Vmax / 2, т. Е. До м чисельно дорівнює концентрації субстрату [S], при якій швидкість реакції складає половину максимальної величини. Це рівність може використовуватися для визначення константи Міхаеліса-Ментен.

Рівняння Міхаеліса-Ментен (5.12) можна перетворити аналогічно перетворень Гендерсона-Гассельбаха для дисоціації слабких електролітів:

або

коли Кінетична крива ферментативної реакції

Мал. 5.7. Кінетична крива ферментативної реакції

На рис. 5.7 показана кінетична крива ферментативної реакції, побудована за рівнянням Міхаеліса-Ментен, що представляє собою гіперболічного залежність стаціонарних швидкостей катализируемой ферментом реакції від концентрації субстрату.

Для графічного визначення До м рівняння (5.12) може бути перетворено наступним чином:

з якого випливає лінійна залежність 1 / v від 1 / [S].

Подібне перетворення першими запропонували Г. Лайнуівер і Д. Берк, тому рівняння (5.13) і графік (рис. 5.8) носять їх імена. Тангенс кута нахилу прямої на рис. 5.8 дорівнює співвідношенню

Графік Лайнуівера-Берка

Мал. 5.8. Графік Лайнуівера-Берка

До м / v max , величина, відсікає на осі 1 / v, відповідає значенню

1 / Гтах *

Якщо на графіку (див. Рис. 5.8) провести лінію до перетину з віссю 1 / [S], то в точці 1 / v = О 1 / [S] - • -1 / * м-

Таким чином, при експериментальному визначенні швидкості процесу мінімум при двох різних концентраціях субстрату можна отримати константу К м .

 
Переглянути оригінал
< Попер   ЗМІСТ   ОРИГІНАЛ   Наст >